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            前沿活細胞熒光成像技術




            前沿活細胞熒光成像技術



            全內反射熒光顯微鏡(Total internal reflection fluorescence microscopy,TIRFM)選擇性的激發樣品特定的(與玻璃-水界面相鄰的)區域內的熒光探針并對其成像。當入射光在玻璃-水界面發生全反射的時候,會產生一個衰逝波,并開始指數型衰減,因此大約能穿透樣品大約100nm。這項技術在對質膜的研究,例如胞吐過程的研究中應用廣泛。TIRFM也是一種用來觀測單分子的非常有價值的方法。


            熒光共振能量轉移(Forster resonance energy transfer,FRET)顯微成像是一種同時使用兩種熒光探針的成像技術。其中一個熒光探針的發射譜與另一個熒光探針的激發譜重疊。前者被稱為FRET供體,后者被稱為受體。當供體和受體分子之間的距離小于10nm的時候,對于供體探針的激發會引起能量轉移導致受體的發射。在FRET成像中ECFP和EYFP通常被作為一個熒光探針對來使用。FRET現象可以用于目的分子構象改變的研究:將受體分子和供體分子設計到一個能和目的分子發生相互作用的熒光蛋白內。當目標分子被激活并且其構象產生改變時,受體和供體探針就能夠靠的足夠近以產生FRET信號。使用這種方法我們已經能夠檢測包括鈣、蛋白酶、cAMP和激酶在內的一系列分子。


            熒光壽命成像顯微鏡(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy,FLIM)可以觀測熒光分子的處于激發態的壽命。FILM可以依據激發壽命將FRET供體和非相互作用的供體區分開,并提高FRET的信噪比。FILM的空間分辨率很高。它通常用于長時間的活細胞觀察。最近,又發展出寬場多參數熒光壽命成像顯微鏡(wide-field multi-parameter FLIM,WFMP-FLIM)。這種方法采用了常規的熒光顯微鏡,但是對視場同時進行雙波長成像,并采用一個空間敏感的光子計數器進行檢測。時域熒光壽命成像(Time domain fluorescence lifetime imaging microscopy,TD-FLIM)能夠在皮秒和亞微米的分辨率下,直接檢測熒光探針的熒光衰退率。


            活細胞成像通常被用來觀測細胞內的分子運動。目前已有多項顯微成像技術能夠實現這一目標。漂白后熒光恢復(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)就是這樣一項技術。在進行FRAP實驗時,需要使用高強度的光將亞細胞區域光漂白,然后檢測熒光隨時間恢復的情況。熒光恢復的速率取決于熒光分子擴散或者主動運輸到漂白區域的數量。圖五展示了一常規的FRAP的例子。FRAP還可以用來研究分子通過縫隙連接的運動過程。漂白后熒光損失實驗(Fluorescence loss in photobleaching,FLIP)和漂白后熒光恢復實驗類似,但是漂白區域是被持續的漂白。


            熒光相關譜(Fluorescence correlation spectroscopy,FSC)是一種通過測量小體積內短時間熒光強度漲落來獲取目標分子擴散速率和濃度的方法。單分子示蹤技術(Single-molecule tracking,SPT)能夠檢測熒光標記的單分子隨時間變化的擴散過程。這種方法對要求非常敏感的相機和先進的專業技術,但是它有助于人們理解諸如驅動蛋白和動力蛋白的馬達蛋白的運動。


            光激活定位顯微成像(Photoactivated localization microscopy,PALM )每次能隨機的獲得很少一部分染料分子的熒光發射圖像,將這些圖像組合起來就可以得到一副PLAM圖像。PALM獲得的圖像空間分辨率非常高,可以到達20nm。但需要特別注意的是PLAM要使用能被激活并轉化的熒光分子。





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